克日，壹定发生物与相助单元华中农业大学农业微生物学国家重点实验室在Journal of Applied Microbiology上揭晓了题为“Transcriptome analysis reveals the underlying mechanism for over-accumulation of alkaline protease in?Bacillus licheniformis”的研究效果。gai研究基于GenoLab M高通量基因测序仪完成了碱性卵白酶的高产菌株Bacillus licheniformis?AQ在50 L发酵罐全历程（8个时间段）的转录组测序以剖析其高表达碱性卵白酶机制。在发酵终点（48 h)时，碱性卵白酶到达峰值（42,020 U/mL），其他时间点与这个时间点较量，获得各组差异表达基因。随后取其各组差异表达基因的交集，获得61个基因，对它们的功效剖析发现：这些基因的编码卵白主要加入了剖析代谢历程、肽酶和抑制剂、朋侪和折叠催化等过程。
碱性卵白酶(AprE)是一种主要的工业酶，普遍应用于食物加工、洗涤剂工业、皮革业、生物转化反映、废物处置赏罚、生物活性肽合成等领域。在全球规模内，AprE占有了50%以上的酶工业。然而，现在的AprE产量仍然不能知足工业需求，导致了大规模工业酶欠缺。因此，进一步提高AprE产率具有辽阔的工业应用远景。许多微生物都能合成AprE，而其中芽孢杆菌属Bacillus具有显着优势，它们属于公认清静菌株，其卵白渗透能力强，易于作育，发酵周期短，工业发酵稳健性强，基因修饰利便，例如B. licheniformis，可以敲除调控因子sig F，阻止芽孢形成，使得AprE的酶活提升20%，到达29,494 ± 1053 U/mL。安琪酵母股份有限公司拥有一株高产AprE的菌株，B. licheniformis?AQ，本ci收罗了50 L大罐发酵的8个主要时间点样本测定了AprE的酶活等理化指标，并提取RNA完成转录组测序。
01?AprE发酵历程中的基因表达模式
gai研究的8份样本转录组测序，一共获得242 M高质量reads，检测到3821个基因在发酵历程中表达，占菌株总基因的91.74%。显然，发酵终点(48 h)时高表达基因最多(a)。由于AprE酶活在发酵终点(48 h)时最高，因此，以48 h作为对照，举行差异表达基因（DEG）剖析，24 h时DEG数目最多，其ci是32 h(b)。七个较量组的DEG的交集一共涉及61个基因(c)。通过功效富集剖析发现这61个基因主要加入生物历程，尤其是氨基酸、α -氨基酸、有机酸、有机氮化合物等众多剖析代谢历程(d)。而肽酶和抑制剂、朋侪卵白和折叠催化(KEGG)和胞外区域(GO_Cellular component)等功效富集最为显著。DEG中最多的功效是肽酶和抑制剂。高效的卵白渗透和折叠是芽孢杆菌重组卵白生产的关jian。这些历程由转运系统的组分以及细胞内和胞质外的朋侪卵白辅助完成。这部门富集剖析效果也证实了在AprE发酵历程中渗透和折叠活性很是活跃。
02??AprE发酵历程中的潜在调控网络
研究人yuan查阅文献，并团结转录组测序效果，一共挑选了30个卵白，它们可能与AprE合成相关，通过与STRING数据库举行剖析，绘制PPI（卵白相互作用）网络，最终获得了22个卵白的网络信息。Spo0A位于中心，拥有节点数最多(11个)，其ci是CodY (9个)、sigH (9个)和ArbB (8个)。而这些卵白的编码基因表达量热图显示，AprE基因的表达量在24 h到达峰值，随后下降，在32 h到达第二岑岭，随后下降，发酵竣事时略有上升。右下5个sigma因子的表达模式与AprE略有差异。
03?qRT-PCR验证转录组表达量
研究人yuan挑选了与AprE合成相关的20个关jian基因举行qRT-PCR验证，包罗芽孢形成的16个调控基因，4个全局调控基因。qRT-PCR数据显示：大多数基因在32 h时表达水平较高。而转录组数据显示大部门基因在24 h时表达水平较高，但未检测到qRT-PCR数据。虽然qRT-PCR与RNA-seq数据存在一定差异，但大部门基因的表达趋势是一致的，证实晰转录组数据的可靠性。
1.?gai研究首先考察了B. licheniformis?AQ在工业发酵历程中差异时间点碱性卵白酶的转变。效果批注，发酵历程中碱性卵白酶一直积累，在发酵48 h时到达最大值；
2.?发酵全历程的转录组测序效果显示：表达量最高的基因在发酵竣事时(48 h)最多；
3.?构建了潜在的PPI网络，并使用qRT-PCR手艺对AprE发酵历程中关jian基因的表达水平举行了验证。
Ji A, Zheng X, Yang W, et al. Transcriptome analysis reveals the underlying mechanism for over-accumulation of alkaline protease in Bacillus licheniformis[J]. Journal of Applied Microbiology, 2023: lxad319.